使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。

　　最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。

　　大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。

　　建议使用1.75mmol/LMgCl2∶350mmol/LdNTP或2.25mmol/LMgCl2∶500mmol/LdNTP组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。

　　基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。

　　要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。

　　降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

　　变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12kb时，应该尽可能的降低变性温度。

　　延伸：68--72℃下进行延伸操作。

　　循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。

　　长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。

　　测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。